Abstrak
Metaloproteinase matriks (MMPs) terungkap karena perannya dalam metamorfosis khewan amfibi, di mana hingga kini mereka telah menyita lebih banyak perhatian lagi karena perannya dalam penyakit. Meski telah melalui pengamatan teliti in vitro, dalam kultur sel dan dalam banyak model binatang, berbagai peranan fisiologis normal dari berbagai protease ekstrasel ini masih sulit untuk difahami. Banyak studi terkini pada tikus kecil dan lalat menunjuk ke pada peran-peran MMPs sebagai mediator perubahan dan pengadaptasian fisik dalam jaringan, apakah teregulasi mengikuti perkembangan (developmentally), terinduksi lingkungan ataukah terkait penyakit.
Pendahuluan
Temuan anggota dari famili metaloproteinase matrix (MMP), kolagenase, yang diidentifikasikan pada 1962 oleh Gross dan Lapiere, mendapatkan bahwa kecebong selama masa metamorfosisnya mengandung enzim yang dapat mendegradasi kolagen fibriler (1, 2). Selanjutnya, suatu kolagenase interstisiil, kolagenase-1 atau MMP1, ditemukan pada penyakit kulit dan sinovium (3). In vitro, MMP1 menginisiasi pendegradasian kolagen-kolagen fibriler aslinya, yang merupakan komponen sangat penting dari matriks ekstrasel tulang belakang, dengan cara memutus ikatan peptid antara Gly775-Ile776 atau Gly775-Lys776 dari bentuk asli molekul-molekul kolagen tipe I, II atau III (3, 4). Penelitian lebih lanjut mengawali bagi pengungkapan sebuah famili dari berbagai proteinase yang terkait secara struktural (23 pada manusia, 24 pada tikus kecil), yang saat ini disebut sebagai famili MMP.
Ketertarikan terhadap MMP semakin meningkat dalam akhir tahun 1960-an dan awal 1970-an setelah banyak observasi mendapatkan bahwa MMP diregulasi ke hulu dalam berjenis penyakit manusia meliputi arthritis rheumatoid dan kanker. Pentingnya, level-level tinggi MMPs seringkali terkait dengan prognosis buruk bagi pasien-pasien manusia (5). Bagaimanapun, data klinis terkini mengindikasikan bahwa hubungan antara MMPs dan penyakit tidaklah sederhana; sebagai contoh, meningkatnya aktifitas MMP dapat menguatkan progresi tumor atau dapat menghambatnya (6). Hubungan kompleks antara pengekspresian MMP dan kanker telah meningkatkan ketertarikan terhadap pengetahuan dasar dan klinik dalam memahami fungsi MMP in vivo, namun juga perhatian difokuskan pada MMPs dan patologi, dan perhatian yang agak kurang difokuskan pada peran normal enzim-enzim ini. Sebenarnya kita tidaklah memiliki 23 MMPs dalam tubuh hanya untuk mendorong pertumbuhan tumor. Sebuah pertanyaan yang masih belum terjawab adalah, apakah sebenarnya fungsi normal famili gen MMP dalam proses perkembangan? Tinjauan ini memokuskan pada apa yang telah kita pelajari sekitar fungsi-fungsi normal MMPs in vitro dari analisis genetik.
MMPs in vivo: analisis dari mutan-mutan MMP
Analisis dari penghentian genetik (genetic knockouts) MMPs menawarkan banyak kesempatan untuk mengidentifikasi fungsi-fungsi esensiil dari suatu MMP dan untuk memvalidasi berbagai substrat kandidat dengan cara mencari produk-produk pecahan (cleavage products) dalam khewan-khewan kontrol dan protein-protein takterpecahkan dalam khewan-khewan mutan. Sedikitnya 14 jenis tikus kecil mutan yang telah dihasilkan. Pengkarakterisasian awal telah menjelaskan dengan takterduga fenotip-fenotip yang hampir tak kentara, dengan keseluruhan MMP-knokcout lines tetap bertahan hidup hingga lahir (Tabel 1). Penjelasan yang mungkin bagi “seperti takterpakainya” (the seeming dispensability) MMPs sepanjang masa perkembangan embryonik adalah meliputi: kebergantungan enzimatik (enzymatic redundancy), kompensasi dan perkembangan adaptif enzimatik, meski adalah memungkinkan bahwa MMPs tidaklah penting hingga setelah masa perkembangan embryonik. MMPs memiliki banyak substrat yang bertumpang-tindih in vitro (5), yang mengindikasikan kebergantungan genetik (genetic redundancy) in vivo. Memang, kebergantungan (redundancy) seperti itu saat ini ditunjukkan dengan generasi terkini dari MMP double mutants (7, 8). Pengompensasian juga diperlihatkan dalam famili MMP (9, 10). Dalam bagian tulisan berikut ini, akan didiskusikan berbagai fenotip tikus kecil mutan yang mengandalkan pada berbagai teknik pendekatan genetik. Para peneliti dapat juga saat ini mengambil keuntungan dari sistim model genetik yang lebih sederhana, seperti misalnya Drosophila melanogaster, pada mana memungkinkannya untuk memutasikan keseluruhan gen MMP.
Proteolisis MMP
MMPs merupakan anggota dari kelompok metzincin dari protease, yang dinamai demikian setelah ion zeng dan residu Met yang terkonservasi terletak pada lokasi aktif (active site) (11, 12). Seluruh usaha terkini telah menyiptakan sebuah nomenklatur peptidase terunifikasi (13) pada mana MMPs meliputi subfamili M10A, famili M10 dan MA clan of metallopeptidases. MMPs mamalia berbagi sebuah struktur domain terkonservasi (gambar 1) yang terdiri dari sebuah domain katalitik dan sebuah pro-domain otoinhibitor. Pro-domain terdiri dari sebuah residu Cys terkonservasi yang mengkoordinasi lokasi aktif zeng untuk menghambat katalisis. Ketika pro-domain distabilisasi atau dibuang, lokasi aktif menjadi tersedia bagi penerimaan substrat-substrat pemecahan. Kebanyakan anggota famili-MMP juga mengandung sebuah domain hemopeksin, terikat pada C termini mereka melalui suatu gantungan fleksibel. Domain hemopeksin mengkode a four-bladed β-propeller structure yang memediasi berbagai interaksi protein dengan protein . Domain ini juga menyumbang bagi ketepatan pengenalan substrat, pengaktifasian enzim, pelokalisasian, penginternalisasian dan pendegradasian protease (14). Struktur domain-domain katalitik dan hemopeksin dari beberapa MMPs, termasuk MMP1, MMP2, MMP3 dan MMP4 (juga dikenal sebagai MMP tipe 1 membran [MT1-MMP]), telah dapat diuraikan (13, 15). MMP2 dan MMP9 juga memiliki pengulangan fibronektin tipe II, yang memediasi pengikatan dengan kolagen, diinsersikan ke dalam domain katalitik. Kebanyakan MMPs merupakan protein tersekresikan; bagaimanapun, mereka adalah enam buah MT-MMPs: MMP14, MMP15, MMP16 dan MMP 24 memiliki domain transmembran dan ekor sitoplasmik pendek; MMP17 dan MMP25 memiliki linkage glikosilfosfatidilinositol (GPI). Juga, MMP23 merupakan suatu protein transmembran tipe II. Aktifitas MMPs dikontrol pada banyak level dan pengaturan aktifitas MMP masih tetap merupakan satu topik penelitian yang intens (BOX 1)
Fungsi dari Proteolisis MMP
Riwayatnya, MMPs disangka berfungsi utama sebagai enzim yang mendegradasi komponen-komponen structural ECM. Bagaimanapun, proteolisis MMP dapat menyiptakan ruang bagi sel-sel untuk bermigrasi, dapat memroduksi fragmen-fragmen pemecahan substrat spesifik dengan aktifitas biologis yang bebas, dapat mengatur arsitektur jaringan melalui berbagai efek pada ECM dan intercellular junction, dan dapat mengaktifasi, mendeaktifasi atau memodifikasi aktifitas molekul-molekul pensinyalan, baik secara langsung maupun tidak langsung (16) (Gambar 2). Oleh karena sebuah sel adalah memiliki reseptor (sebagai misal, integrin) bagi komponen ECM struktural, MMPs dapat juga memengaruhi fungsi sel melalui pengaturan protein-protein ECM lewat mana sel-sel berinteraksi (17). Dalam banyak kasus, substrat ECM hasil pemecahan MMP membangkitkan fragmen-fragmen yang memiliki banyak aktifitas biologis berbeda dari prekursor-prekursor mereka. Sebagai contoh, pemecahan laminin-5 atau kolagen IV menghasilkan adanya paparan lokasi kriptik yang mendorong migrasi (18, 19). Pendegradasian kolagen tipe I yang dimediasi oleh MMP1 adalah perlu bagi migrasi sel epitel dan penyembuhan luka dalam model-model kultur (20). Pemecahan protein-protein ECM oleh MMPs dapat juga melepaskan faktor-faktor pertumbuhan yang terikat ECM, termasuk insulin growth factors dan fibroblast growth factors (21, 22). Berbagai mekanisme aksi alternatif telah juga terobservasi, meliputi kompleks-kompleks MMP intermolekuler fungsional: MMP14 berikatan dengan tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP2), yang berikatan dengan Pro-MMP2, sehingga memosisikannya bagi pengaktifasian oleh sebuah molekul kedua MMP14 (23). Lebih lanjut, MMP11 manusia memiliki sebuah alternatif splice isoform yang fungsinya sebagai satu proteinase intraseluler dan memasuki nukleus (24).
Substrat MMP meliputi peptide growth factors, tyrosine kinase receptors, cell-adhesion molecules, sitokin dan khemokin, demikian juga MMPs lainnya dan berbagai protease yang tak terkait (BOX 2). MMPs dan berbagai famili proteinase terkait, ADAMs (a disintegrin and metalloproteases) dan ADAM-TSs (ADAMs dengan thrombo spondin repeats) adalah penting dalam penyimbahan (shedding) protein membrane-plasma-bound. ADAMs dan ADAM-TSs berpartisipasi dalam penyimbahan berbagai faktor pertumbuhan yang disintesis berupa bentuk-bentuk prekursor cell-membrane-bound, meliputi heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF), neuregulin, amfiregulin dan transforming growth factor- α (TGFα) (25-28). Pemecahan berbagai protein membran lainnya, seperti misalnya E-kadherin dan CD44, menghasilkan pelepasan fragmen-fragmen spesifik dan aktif secara biologis dari domain ekstrasel mereka, dan meningkatnya tingkah laku invasif (29, 30). Molekul-molekul cell-surface-adhesion, seperti misalnya sindekan-1 juga disimbahi oleh MMPs membran yang dapat larut (31, 32). MMP9 dan MMP12 menyumbang bagi penyimbahan proteolitik dari lipopolisakharid (LPS) reseptor CD14, dan karenanya memengaruhi daya tahan inang bawaan (33). TGFβ merupakan substrat MMP penting lainnya, yang mana pengaktifasiannya seringkali mengubah migrasi sel; sebagai contoh, MMP9 membatasi migrasi epitel kornea lewat pengaktifasian TGFβ (34). Baik MMP4 maupun MMP9 dapat melepaskan TGFβ dari sebuah kompleks ekstrasel tak aktif, yang mengandung TGFβ, TGFβ latency-associated proteine (yang merupakan pro-domain TGFβ), dan latent TGFβ-binding proteine (35).
Sebuah tantangan yang saat ini sedang berlangsung adalah mengaitkan pemahaman kita tentang substrat MMP yang telah teridentifikasi in vitro atau dalam kultur sel dengan substrat yang dipecah oleh MMPs in vivo. Keterbatasan dari teknik pendekatan saat ini adalah bahwa MMPs sering kali diekspres sebagai domain katalitik tersendiri (isolated) tanpa domain hemopeksin pengenal-substrat mereka. Semua domain katalitik ini telah terbukti berkemampuan memecah ratusan jenis substrat in vitro, termasuk hampir keseluruhan komponen ECM.
MMPs dalam Modelling dan Remodelling tulang
Tulang merupakan sebuah lokasi penting bagi remodelling jaringan yang terjadi selama proses perkembangan, homeostasis dan perbaikan. Tulang berkembang atas dasar satu dari tiga buah proses berbeda: osifikasi intramembran, osifikasi endokhondral (Gambar 3A) atau osifikasi pseudo-metamorfik. Klavikula dan beberapa tulang kepala berkembang melalui osifikasi intramembran, pada mana prekursor-prekursor mesenkhim berdiferensiasi secara langsung menjadi osteoblas. Tulang apendikuler dan aksial, termasuk tulang panjang, berkembang melalui osifikasi endokhondral, di mana sebuah template kartilago dibentuk mula-mula dan kemudian diserap dan digantikan oleh tulang bermineralisasi. Sel-sel kartilago, atau khondrosit, berdiferensiasi dan digantikan pada plat pertumbuhan, di mana mereka mengikuti sebuah stereotyped progression dari proliferasi, diferensiasi, hipertrofi, penginvasian angiogenik dan apoptosis. Pada osifikasi pseudo-metamorfik, sebuah template kartilago berfungsi sebagasi sebuah temporary mould untuk membentuk deposisi tulang. Bahkan ketika tulang telah terbentuk, mereka terus menerus di-remodel sepanjang kehidupan.
Kehilangan MMP9 adalah dikaitkan dengan defek-defek plat pertumbuhan
Fenotip perkembangan tubuh yang pertama dilaporkan dalam sebuah percobaan menggunakan tikus kecil yang dikondisikan MMP-knockout adalah sebuah defek dalam osifikasi endokhondral tulang panjang (36). Dilesi/penghilangan Mmp9 menghasilkan penginvasian zona khondrosit hipertrofik dalam plat pertumbuhan (36) akibat dari gagalnya apoptosis (Gambar 3b). Sebuah substrat MMP9 yang relevan nampaknya adalah galektin-3, suatu lektin dengan aktifitas anti-apoptotic yang dapat disekresikan dan dilokalisasikan ke ECM. MMP9 memecah dan menginaktifasi galektin-3. Memang, tikus-tikus kecil mutan-galektin-3 mempertunjukkan berbagai defek plat pertumbuhan yang berlawanan dari berbagai defek yang diperlihatkan pada tikus-tikus kecil defisien-Mmp9, dengan premature apoptosis sel-sel khondrosit hipertrofi (37). Galektin-3 yang tak terurai adalah juga berlimpah secara spesifik dalam plat pertumbuhan pada mutan-mutan Mmp9. Galektin-3 tak terurai, yang ditambahkan dari luar ke pada wild type bone explants, menyebabkan suatu pengekspansian plat pertumbuhan yang adalah sama halnya pada fenotip mutan-mutan Mmp9, di mana galektin-3 yang terurai tidak memiliki efek (38).
MMP9 juga diekspresikan kuat selama penyembuhan tulang setelah fraktur, dan fraktur-fraktur tulang pada tikus-tikus kecil mutan-Mmp9 sembuh lebih lambat dibandingkan kontrol. Exogenous vascular endothelial growth factor (VEGF) menyelamatkan defek perbaikan jaringan, yang mengindikasikan bahwa MMP9 processing of VEGF dapat merupakan tingkat laju penghambatan (rate limiting) dalam perbaikan tulang (39). Menariknya, khewan-khewan Mmp9-null menyembuh dari fraktur-fraktur yang distabilisasi dengan cara osifikasi endokhondral dari pada lewat osifikasi intramembran seperti halnya dalam wild type (39), mengindikasikan bahwa sebuah mekanisme berbeda digunakan untuk menyembuhkan fraktur dalam ketidakhadiran MMP9.
MMP13 berfungsi dalam Pembentukan dan Remodelling tulang
Mutan-mutan Mmp13 memerlihatkan suatu pengekspansian terhadap zona khondrosit hipertrofi dan sebuah perlambatan dalam apoptosis, mengindikasikan bahwa MMP13 adalah diperlukan bagi pentransisian dari bentuk kartilago ke bentuk tulang pada plat pertumbuhan tulang-tulang panjang (7, 40) (Gambar 3b). MMP13 memecah kolagen tipe II dan aggrekan in vivo, dan produk pecahannya dapat dikenali dalam zona tight yang berada tepat di distal zona osifikasi dan angiogenesis. Defek utama dalam mutan-mutan Mmp13 adalah adanya kegagalan sel-sel khondrosit me-remodel ECM yang kaya dengan kolagen tipe II dan aggrekan. Pemecahan kolagen tidak terjadi pada ketidakhadiran MMP13, pada mana baik MMP13 maupun MMP9 memecah aggrekan. Produk pecahan aggrekan tidak ada dalam mutan ganda Mmp13Mmp9 (7). Adalah perlu diperhatikan bahwa tidak terdapat konsekuensi fenotipik dari penggantian aggrekan endogen dengan aggrekan yang tahan terhadap pemecahan MMP, ini mengindikasikan bahwa berbagai mekanisme lain hadir untuk membuang aggrekan pada proses cartilage-bone transition (41). Fungsi kedua MMP13 dalam perkembangan tulang panjang terjadi selama masa osifikasi. ECM kartilago menjadi scaffold bagi mineralisasi, membentuk spikula atau trabekula tulang. Mutan-mutan Mmp13 memerlihatkan spikula-spikula tulang berbentuk tak beraturan, ini menunjukkan bahwa MMP13 adalah diperlukan bagi modelling awal mereka (7).
MMP13 juga berfungsi dalam proses remodelling berkelanjutan dari spikula; mutan-mutan Mmp13 memiliki peningkatan tak normal dalam massa tulang trabekuler yang tetap bertahan hingga masa dewasa. Mutan-mutan Mmp13 kondisional dalam tulang atau kartilago memerlihatkan bahwa pengaturan apoptosis khondrosit hipertrofi oleh MMP13 dan fungsi modelling spikula awal bermediasikan MMP13 adalah terletak dalam sel-sel khondrosit. Fungsi remodelling bermediasikan MMP13 yang mengatur massa tulang adalah terletak dalam sel-sel osteoblas. Maka dari itu, MMP13 adalah berfungsi dalam pembentukan tulang, baik pada plat pertumbuhan maupun pada spikula, dan dalam remodelling tulang.
Defisiensi MMP14 menimbulkan lethalitas
MMP14 memiliki beraneka peran dalam perkembangan skelet. Mmp14 knockouts adalah satu-satunya tikus kecil mutan-MMP yang lethal; tikus-tikus ini adalah normal saat lahirnya namun mengembangkan ketidaknormalan berganda dan mati pada usia 3 – 12 minggu (42, 43). Mutan-mutan Mmp14 dengan jelas menunjukkan defek dalam remodelling jaringan ikat. Hilangnya enzim pendegradasi-ECM dapat diperkirakan akan menghasilkan deposisi tulang meningkat; secara paradoks, alih-alih, mutan-mutan Mmp14 memerlihatkan efek sekunder dari meningkatnya penyerapan tulang dan pusat osifikasi sekunder defektif (42, 43). Sel-sel osteogenik dari tikus-tikus kecil mutan-Mmp14 tidak dapat mendegradasikan kolagen dan tidak membentuk tulang ketika ditransplantasikan secara subkutan ke dalam inangan tikus-tikus kecil yang defisiensi imun (42). Bila diambil bersamaan, fenotip tikus-tikus kecil mutan-Mmp14 dengan kuat menyokong relevansi fisiologis data in vitro, yang memerlihatkan bahwa kolagen tipe I, II dan III merupakan substrat-substrat bagi MMP14 (44).
Beberapa modelling tulang awal adalah juga bergantung pada MMP14. Bentuk pseudo-metamorfik dari proses perkembangan tulang terungkap begitu setelah ditemukannya aberrant residual cartilagenous tissues dalam mutan-mutan Mmp14 (45). Dalam wild-type mice, beberapa tulang kepala dan diafisis dari tulang-tulang panjang dibentuk oleh osteoblas yang meletakkan tulang termineralisasi dalam aposisinya dekat dengan kartilago yang telah ada sebelumnya dan berfungsi sebagai sebuah mould yang belakangan mengalami apoptosis. Tulang-tulang ini berkembang melalui cara penggantian sebuah jaringan juvenile dengan sebuah jaringan dewasa, sebuah proses yang sebanding dengan metaformosis. Dalam ketiadaan MMP14, template kartilago ini tetap tidak mengalami perubahan.
Tikus-tikus kecil Mmp2-Mmp14-null mati saat lahir (8). Mutan-mutan ganda ini menyerupai mutan-mutan Mmp14 tunggal yang jauh lebih dahulu ada, mengindikasikan bahwa fungsi MMP2 dan MMP14 saling tergantung satu sama lain. Adalah jelas bahwa MMP14 mengaktifasi MMP2, oleh karena aktifitas MMP2 dikurangi, bukannya ditiadakan, dalam tikus-tikus kecil MMP14-null. (43, 46). Bagaimanapun, aktifator-aktifator lainnya juga tampil di situ, kemungkinannya meliputi MMP15 dan MMP16. Akhirnya, MMP14 memiliki peranan yang tak bergantung MMP2 dalam remodelling tulang dan jaringan ikat dan selama angiogenesis (8, 43, 46).
Mutasi MMP pada Manusia menimbulkan Defek dalam Proses Perkembangan Tulang
Terdapat tiga jenis kondisi penyakit skelet manusia yang dikaitkan dengan mutasi-mutasi MMP loss-of-function. Ketiganya merupakan sebuah sindrom osteolitik yang jarang, yang disebabkan oleh mutasi-mutasi MMP2 (47), the Missouri variant of spondyloepimetaphyseal dysplasia (SEMD), yang disebabkan oleh point mutations dalam MMP13 (48), dan the tooth enamel defect amelogenesis imperfecta, yang disebabkan oleh mutasi-mutasi splice-acceptor dalam MMP20 (49).
Meskipun tikus-tikus kecil yang kokondisikan Mmp2-knockout memiliki hanya semacam defek skelet tak kentara (50), mutan-mutan MMP2 manusia memilki semacam sindrom osteolitik (vanishing bone), yang meliputi destruksi dan penyerapan tulang progresif, juga dwarfism dan arthritis (47). Defek-defek dari sindrom ini adalah sama dengan pada fenotip tikus-tikus kecil mutan-Mmp14. Sebagaimana halnya dengan tikus-tikus kecil Mmp14, observasi paradoksnya adalah bahwa sebuah mutasi loss-of-function dalam sebuah protease penghancuran-ECM menyebabkan, dari pada penghambatan, pendegradasian tulang. Fenotip ini berhubungan dengan sejumlah berlebihan sel-sel osteoklas, yang mungkin mengompensasi bagi kegagalan primer dari pendegradasian ECM tipe yang lainnya.
Kesamaan antara penyakit manusia yang disebabkan oleh mutasi MMP2 dan tikus-tikus kecil dengan kondisi Mmp14-knockout adalah khususnya menarik dalam menerangkan interaksi biokhemis antara dua jenis protease ini. Membran-bound MMP14 mengaktifasi MMP2 tersekresi melalui pemecahan pro-domain-nya (51, 52). Memang, MMP2 aktif adalah secara bermakna menurun dalam Mmp14-null mice, yang dengan kuat mengindikasikan bahwa MMP2 merupakan suatu substrat in vivo dari MMP14 (43). Karenanya, adalah jelas bahwa MMPs memiliki banyak peran penting dalam perkembangan tulang.
MMPs dalam Remodelling Pembuluh Darah
Analisis dari suatu rentangan lebar mutan-mutan MMP memerlihatkan bahwa perkembangan vaskuler embryonik adalah berlangsung secara normal, sekalipun demikian, defek-defek adalah terobservasi baik dalam remodelling dan angiogenesis vaskuler pascanatal normal maupun patologis (Tabel 1). Data ini menunjukkan secara tak langsung bahwa MMPs mungkin memiliki sebuah peran spesifik dalam proses penyempurnaan (refinement) pascanatal, remodelling dan neoangiogenesis, namun tidak dalam konstruksi asli jejaring vaskuler embryonik.
Tikus-tikus kecil mutan-Mmp9 memerlihatkan defek dalam angiogenesis pada plat pertumbuhan tulang panjang (36). Hal yang sama, tikus-tikus kecil mutan-Mmp14 memerlihatkan rendahnya penginvasian vaskuler yang mencukupi pada pusat-pusat osifikasi sekunder, meskipun level-level VEGF dan reseptornya VEGFR2 (juga dikenal dengan FLK1) adalah normal (43). Kurangnya pertumbuhan vaskuler direkapitulasikan dalam sebuah assay angiogenesis kornea yang terinduksi secara eksperimental (43), yang menginduksi pertumbuhan pembuluh darah baru dalam tikus-tikus kecil kontrol. Pertumbuhan pembuluh darah tidak terobservasi dalam mutan-mutan Mmp14 (43), sedangkan hal ini terreduksi namun tidak dihilangkan dalam khewan-khewan mutan-Mmp2 (55). Dalam sebuah model injuri terinduksi-laser dari degenerasi retina, neovaskularisasi adalah berkurang dalam mutan-mutan tunggal Mmp2 dan Mmp9 dan dengan kuat berkurang pada mutan ganda Mmp2 Mmp9, mengindikasikan bahwa kedua MMPs ini berfungsi saling bergantung (56). Mutan-mutan ganda Mmp2 Mmp14 juga memiliki defek-defek perkembangan vaskuler, termasuk kapiler-kapiler dengan lumen yang sangat kecil. Semua pembuluh darah defektif adalah mencukupi untuk mendukung proses perkembangan dan pertumbuhan embryonik, namun tidak bagi keperluan daya tahan hidup pascanatal.
Bagaimana MMPs berkontribusi ke pada remodelling vaskuler? Mekanisme yang mungkin adalah meliputi proteolisis kolagen tipe I, pemodifikasian pensinyalan platelet-derived growth factor (PDGF), pengaturan sel-sel perivaskuler dan pemrosesan VEGF. Pembuluh-pembuluh darah yang menginvasi dalam jaringan pascanatal menghadapi ECM yang kaya akan kolagen tipe I, jenis protein yang tidak begitu kuat terekspres dalam embryo. Ketika eksplan-eksplan aorta kontrol direndam ke dalam matiks-matriks kolagen tiga dimensi (57), mereka menyebarkan pembuluh-pembuluh baru dan sel-sel endotel menginvasi matriks kolagen dalam sebuah cara-cara yang bergantung faktor pertumbuhan. Secara menyolok, eksplan-eksplan Mmp14-null tidak menyebarkan (sprout) neovaskuler atau menginvasi matriks kolagen, pada mana eksplan-eksplan dari tikus-tikus kecil Mmp2- dan Mmp9-null tidak dapat dibedakan dari eksplan-eksplan kontrol. Bagaimanapun, ketika eksplan-eksplan Mmp14-null direndam dalam sebuah matriks fibrin (yang sama seperti ECM provisional pada sebuah lokasi luka) mereka membentuk kapiler-kapiler, mengunjukkan adanya spesifisitas matriks. Jadi, MMP14 berkontribusi bagi perkembangan vaskuler pascanatal dengan cara memecah kolagen tipe I; ketidakhadiran relatif dari kolagen tipe I dalam embryo mungkin sebagiannya menjelaskan rendahnya defek-defek vaskuler embryonik.
MMP9 dan MMP14 memiliki efek lainnya pada vasculature: sel-sel perivaskuler (atau otot polos) yang membungkus sel-sel endothel pembuluh darah menghilang atau kepadatan mereka secara bermakna menurun dalam pembuluh normal dan selama neoangiogenesis tumor (57-59). Defek ini adalah terbukti secara khusus dalam arteriol-arteriol yang lebih kecil dari otak, dan banyak dari sel-sel perivaskuler sisanya memiliki morfologi takteratur. Fenotip ini adalah sama dengan pada tikus-tikus kecil yang membawa allele PDGF-B lemah. Pensinyalan yang mengatur ke hilir PDGF dihentikan dalam tikus-tikus kecil Mmp14-null, dan PDGF receptor-β (PDGFRβ) ber-co-immunoprecipitates dengan MMP14, mengunjukkan bahwa mereka membentuk sebuah kompleks fisik (60). Semua data ini mengidikasikan sebuah fungsi baru dan langsung dari MMP14 dalam pensinyalan PDGF.
MMPs dan Pensinyalan VEGF
Jenis pemrosesan MMP dari VEGF (MMP processing of VEGF) mungkin memiliki semacam peran penting dalam angiogenesis fisiologis dan angiogenesis tumor. VEGF disimpan di luar sel: setelah sekresinya, VEGF berikatan dengan ECM, dari mana ia harus dilepaskan untuk menginisiasi angiogenesis (61). Bentuk insulinoma kecil yang terutama mengisi dalam model sel-sel Langerhans pankreas tikus RIP1-Tag (rat insulin promoter 1-T antigen), namun hanya 1 -2 % dari padanya berkembang menjadi adenoma dan karsinoma angiogenik (62). Meskipun terdapat pengekspresian berkelanjutan dari VEGF dan reseptornya, VEGFR2, ketersediaan VEGF adalah terbatas dan tidak dapat berikatan ke reseptornya dalam tumor-tumor pra-angiogenik. MMP9 memobilisasi VEGF dan menginisiasi angiogenesis. Pentingnya, ketika mutasi-mutasi Mmp9 disilangkan ke dalam RIP1-Tag background, hanya sedikit tumor yang menjadi bersifat angiogenik, menyokong peran dari MMP9 dalam memobilisasi VEGF (63).
MMPs dapat juga memecah VEGF, memisahkan domain pengikatan-matriks dari domain pengikatan-reseptor. VEGF bentuk takterpecah adalah diperkaya pada sedikitnya sejenis jaringan pascanatal mutan-MMP9, yaitu zona hipertrofik khondrosit (38), yang mengindikasikan bahwa VEGF merupakan sebuah efektor ke hilir yang penting, dan mungkin merupakan sebuah substrat, dari MMP9. Truncated VEGF memiliki banyak efek berbeda pada pembuluh darah tumor dibandingkan yang dikerjakan oleh VEGF bentuk takterpecah; truncated VEGF meningkatkan diameter pembuluh , pada mana VEGF yang tak dapat pecah meningkatkan penyebaran pembuluh (54). Tikus-tikus kecil Mmp9-null mempertunjukkan neovaskulatur pascaembryonik defektif, menyarankan bahwa dalam tikus-tikus kecil liar, pembuluh darah pascanatalnya berrespon secara berbeda terhadap VEGF bentuk terpecah maupun terhadap VEGF bentuk takterpecah. Kemungkinan dari fungsi penginisasian penyebaran pembuluh dari bentuk VEGF tak terpecah adalah merupakan satu-satunya fungsi VEGFyang diperlukan dalam embryo, bagaimanapun, fungsi VEGF ini tidak dipengaruhi dalam embryo-embryo mutan-Mmp9.
MMPs dalam Proses Inflamasi dan Perlukaan
Peranan MMPs tidaklah terbatas pada proses-proses perkembangan, dan banyak eksperimen pada tikus-tikus mutan sedang mulai memerlihatkan bahwa MMPs adalah dibutuhkan guna memertahankan homeostasis dalam berrespon terhadap berbagai tantangan lingkungan, seperti misalnya perlukaan dan infeksi. Di sini secara ringkas didiskusikan berbagai temuannya yang paling penting.
MMP7 adalah Terlibat dalam Imunitas Bawaan dan Penyembuhan Luka
MMP7 (atau matrilisin) tidak memiliki peran daam proses perkembangan dan tidak diekspres pada level-level tinggi dalam perkembangan embryonik. Dalam jaringan dewasa yang sehat, MMP7 diekspres hanya dalam epitel-epitel mukosa dan ia diregulasi ke hulu dan teraktifasi secara proteolitik dalam responnya terhadap paparan bakteri dalam epitel (82). Konsisten dengan pola pengekspresian ini, tikus-tikus kecil mutan-Mmp7 adalah lebih mudah terinfeksi dengan bacteria intestinal. Kepekaan ini sebagiannya adalah disebabkan oleh ketidakmampuan mutan-mutan Mmp7 untuk mengaktifkan secara proteolitik peptid antibiotik endogen, pro-cryptdin. In vivo, prekursor, namun bukan bentuk yang dewasa, dari cryptdin ditemukan dalam contoh-contoh epitel intestinal dari tikus-tikus kecil mutan-Mmp7 (83). Berbagai eksperimen ini dengan kuat memapankan sebuah peran MMP7 dalam imunitas bawaan.
MMP7 adalah juga diperlukan bagi penyembuhan luka. Sel-sel epitel pada tepi-tepi luka eksplan-eksplan trachea bermigrasi menuju kearah satu sama lainnya dan bersatu. MMP7 nampaknya memediasi migrasi epitel yang terinduksi-luka dengan cara memecah E-cadherin (84). MMP7 colocalizes dengan E-cadherin dan memecahkan domain ekstraselnya dalam epitel luka, yang menghasilkan semacam kelonggaran perlekatan sel ke sel. Dalam tikus-tikus kecil mutan-Mmp7 yang luka, sel-sel epitel tidak bermigrasi dan pemecahan E-cadherin tidak terjadi (85). MMP3 juga berfungsi dalam penyembuhan luka epidermal, sebagaimana halnya luka-luka kulit tikus-tikus kecil mutan-Mmp3 menyembuh lebih lambat dibandingkan dengan mereka yang dalam kelompok kontrol, akibat dari defisit dalam actin purse-string formation (86).
Fungsi-fungsi Pro-inflamasi dan Anti-inflamasi MMP
Baik cedera maupun infeksi akan menginduksi inflamasi, sebuah respon fisiologis lain terhadap tantangan lingkungan yang memerlukan MMPs. Epitelium paru mengontrol perekrutan sel-sel inflamasi menuju alveoli, melalui pemroduksian khemoatraktan, setelah cedera, infeksi atau paparan alergen atau bahan kimia. Cedera menginduksi lekosit untuk bermigrasi melewati epithelium ke dalam ruang udara alveolar dalam responnya terhadap gradien khemoatraktan. Transmembrane heparin sulphate proteoglycan syndecan-1 me-squester banyak khemokin. Pembentukan gradien khemoatraktan membutuhkan penyimbahan (shedding) syndecan-1 ectodomain yang bermediasikan MMP. Pelepasan khemokin lanjutannya menghasilkan migrasi lekosit ke dalam ruang-ruang udara dan lalu memerbaiki epitel. Dalam ketidakhadiran MMP7, netrofil tetap tak bergerak di luar epitel pada paru yang cedera, dan kerusakan paru bermediasikan inflamasi lanjutannya dihentikan (32). Migrasi netrofil adalah defektif pada mutan-Mmp7 akibat ketidakhadiran atraktan netrofil CXC-motif ligand-1 (CXCL1; juga dikenal sebagai keratinocyte-derived chemokine [KC]; atau GROα pada manusia) dalam cairan lumen-lumen alveolar. Sebagai simpulannya, cedera akan mendorong pengekspresian MMP7, MMP7 memecah syndecan-1 dan penyimbahan syndecan-1 melepaskan CXCL1, yang merekrut netrofil.
MMPs dapat menjadi pro-inflamasi maupun anti-inflamasi. MMPs memfasilitasi perekrutan sel inflamasi (87, 88) dan membersihkan sel-sel inflamasi (89-91) dengan cara memecah mediator inflamasi, menghasilkan ke dalam sebuah respon inflamasi yang terregulasi dengan ketat (92). Beberapa khemokin, termasuk C-C motif ligand-7 (CCL7) dan CXCL12 (92), merupakan substrat bagi MMP2. MMP9 memecah dan mengaktifasi CXCL6 dan CXCL8 (juga dikenal dengan interleukin-8 [IL8]), sedangkan ia menginaktifasi CXCL1 dan CXCL4 (93, 94). Dalam model-model asthma, eosinofil-eosinofil dari tikus-tikus kecil defisien-Mmp2 atau -Mmp9 gagal bermigrasi ke dalam saluran nafas dan berakumulasi dalam interstitium, sehingga memredisposisi khewan percobaan kekeadaan asfiksi (95, 96). MMP2 dan MMP9 berpartisipasi dalam sebuah regulatory loop yang mengimbangi proses inflamasi alergika. Pengakumulasian eosinofil interstitiil dapat dijelaskan melalui disrupsi gradien-gradien khemokin transepitelial, yang memengaruhi CCL7 (juga dikenal sebagai MCP3 atau MARC), CCL11 (juga dikenal sebagai eotaxin) dan CCL17 (juga dikenal sebagai TARC). MMP2 dan MMP9 juga memroses S100A8 dan S100A9, dua macam protein khemoatraktan yang spesifik-netrofil dan spesifik-makrofag yang dijumpai dalam cairan bronkhoalveolar dari tikus-tikus asmatik (97). Kedua MMPs ini memapankan gradien khemotaktik yang dibutuhkan bagi pembersihan sel-sel inflamasi paru dan pencegahan dari asfiksi lethal. Dalam sebuah model tikus kecil berpenyakit autoimmune skin blistering, bullous pemphigoid, tikus-tikus MMP-9 null mengurangkan perekrutan netrofil dan gagal untuk mengembangkan epidermal blistering. Defek ini disebabkan oleh kurangnya penginaktifasian dari α1-proteinase inhibitor oleh MMP9, yang tidak mengijinkan elastase netrofil untuk berfungsi (98).
Truncation of macrophage-derived CCL7 oleh MMP2 dan MMP14 mengakibatkan pembentukan peptid-peptid yang dapat berikatan dengan reseptor khemokin CC dan berfungsi sebagai antagonis-antagonis (99-101). Terbatasnya pemrosesan proteolitik terminal (terminal proteolytic processing) dari CXCL8 dan dari CXC khemokin LIX (the mouse equivalent dari CXCL5 dan CXCL6) oleh MMP9 dan MMP8, berturutan, menimbulkan pembangkitan khemoatraktan yang adalah lebih poten dibandingkan molekul-molekul full-length-nya (102, 103). Karenanya, khewan-khewan Mmp8-null (104) adalah terlindungi dari hepatitis lethal yang terinduksi tumour necrosis factor-α (TNFα) oleh karena terganggunya pelepasan LIX dan kerusakan influx lekosit ke dalam liver (103). Sebuah khemoatraktan netrofil tripeptid N-acetyl Pro-Gly-Pro, derived dari pemecahan ECM, berbagi homologi rangkaian dan struktur dengan sebuah domain penting pada khemokin-α dan menyebabkan khemotaksis lewat CXCR2 (105).
MMPs dalam Model-model Penyakit Inflamasi Manusia
Kebanyakan pathologi pada manusia memiliki sebuah komponen inflamasi, sebagaimana halnya pada model-model tikus. MMP yang sama dapat memiliki peran-peran berbeda dalam kondisi-kondisi berbeda. Sebagai contoh, MMP9 menyumbang bagi inflamasi dalam model-model tikus dengan stroke, serangan jantung, penyakit dari Alzheimer, beberapa aspek dari asma dan kondisi-kondisi inflamasi paru, aneurisma aorta dan encefalomyelitis otoimun (9, 106-110), bagaimanapun, ia berfungsi sebagai sebuah agen antiinflamasi dalam model-model penyakit-penyakit inflamasi kulit dan ginjal (89, 112, 112). Data saat ini mengindikasikan bahwa MMP12 menyumbang bagi emfisema (113, 114), sedangkan MMP3 dan MMP9 menyumbang bagi kondisi-kondisi inflamasi kulit (89, 115). Sebaliknya, MMP8 melindungi dari respon-respon inflamasi kulit (104) dan MMP2 melindungi dari inflamasi otak dan medula spinalis (116). Secara kolektif, berbagai observasi ini mengindikasikan bahwa MMPs berfungsi secara bebas dalam mengatur inflamasi, hal mana secara potensiil memberi kebermaknaan medik yang besar. Memang, progresi tumor juga memicu inflamasi, dan bahwa dalam observasi klinis didapatkan MMPs diregulasi ke hulu pada kanker, hal ini kemungkinan merefleksikan peran MMPs dalam pemicuan dan pengontrolan inflamasi.
Simpulan dan Arah Pemikiran ke Depan
Famili MMP dari proteinase-proteinase ekstrasel terdapat dalam kebanyakan organisme multisel, termasuk tanaman dan binatang (13). Fungsi MMP dapat menjadi sangat mudah dianalisis pada D. Melanogaster, yang hanya memiliki dua buah gen MMP. Mutan-mutan lalat ini mengunjukkan bahwa MMPs adalah dapat menjadi tidak terpakai baik secara sendiri-sendiri maupun bersama-sama bagi perkembangan embryonik lalat, namun menjadi sangat penting bagi pertumbuhan jaringan dan remodelling jaringan-ECM pada larva dan selama perkembangan masa larva. Pada mamalia, sebanyak 24 gen MMP nampaknya berbagi fungsi saling bergantung. Analisis dari tikus-tikus kecil mutan-MMP tunggal (Tabel 1) telah megidentifikasi fenotip-fenotip developmental dalam perkembangan payudara, skelet dan sirkulasi pascanatal, tiga di antara lokasi menonjol dari remodelling jaringan dan ECM pascanatal. Sebuah aspek mengejutkan dari fenotip-fenotip ini adalah bahwa MMPs adalah tidak dibutuhkan dalam membangun pembuluh-pembuluh darah atau tulang pada embryo, namun diperlukan bagi perkembangan pascanatal dan remodelling jaringan mereka. Pemeriksaan dari mutan-mutan tikus juga memerlihatkan sebuah fungsi penting MMPs dalam peregulasian respon jaringan terhadap berbagai tantangan lingkungan, seperti misalnya perlukaan, infeksi dan inflamasi. Analisis genetik dari manusia dan sistim model mendebatkan sebuah peran penting MMPs sebagai regulator aktif perkembangan jaringan pasca-natal, remodelling jaringan dan perbaikan jaringan sebagai responnya terhadap cedera, infeksi atau penyakit.
Berbagai usaha saat ini untuk menghilangkan MMPs tikus yang tersisa dan analisis berkelanjutan dari mutan-mutan yang ada akan memunculkan bagaimana MMPs disebarkan dalam hal perkembangan dan penyakit. Berbagai studi lebih lanjut dengan compound knockouts dapat menghasilkan fenotip-fenotip lethal, sehingga memunculkan peran-peran esensiil dalam proses perkembangan. Mengomplementasikan analisis dari mutan-mutan tikus compound (compound mouse mutants) akan menjadi eksperimen-eksperimen yang menggunakan banyak manipulasi farmakologis baik individu maupun klas-klas MMPs, juga berbagai analisis dalam sistim-sistim model yang dapat tertelusuri secara genetik. Berbagai tantangan biokimia adalah meliputi pemvisualisasian aktifitas MMP dalam sel-sel dan jaringan hidup, perkembangan dari substrat-substrat yang tak dapat terpecahkan dan penentuan dari degradome MMP komplit in vitro (117). Sebuah pertanyaan penting adalah, seberapa besarkah peran MMPs dalam remodelling jaringan versus sebuah peran dalam peregulasian akses ke molekul-molekul pensinyalan. Tantangan lainnya adalah, menentukan kepentingan relatif dari proteolisis ekstrasel secara umum, dan proteolisis bermediasikan-MMPs secara khusus, sebagai sebuah mekanisme pengaturan pasca-translasional dalam proses perkembangan dan penyakit. Stadium-stadium yang mana dalam masa perkembangan normal, proses-proses seluler yang mana dan jalur-jalur pensinyalan yang mana yang dipengaruhi dengan kuat oleh MMPs? Sebuah kunci untuk menjawab semua pertanyaan ini akan meningkatkan pemahaman kita tentang substrat-substrat in vivo relevan bagi MMPs spesifik. Tantangannya adalah, mengaitkan pemahaman in vitro kita tentang fungsi-fungsi potensiil MMPs dengan sebuah pemahaman in vivo tentang bagaimana fungsi MMPs dalam sebuah proses seluler yang ada. Menggabungkan teknik pendekatan biokimia dan genetik MMPs dengan substrat-substrat mutan harus menjadi mungkin untuk membuat kemajuan bagi pemecahan permasalahan penting ini.
Secara konseptual, satu di antara banyak kemajuan utama dalam biologi MMPs telah terrealisasikan yaitu, bahwa proteolisis ekstraseluler bukanlah hanya merupakan sebuah mekanisme penghancuran struktur atau informasi. Malahan, studi-studi yang berbeda-beda mengunjukkan bahwa MMPs dapat melepaskan faktor-faktor pertumbuhan dari ECM dan permukaan sel, mengaktifasikan protein-protein laten dan membangkitkan molekul-molekul bioaktif melalui proteolisis (BOX 2). Bersama kita memandang bahwa proteolisis ekstraseluler adalah sebagai sebuah bentuk lain dari modifikasi pasca-translasional. Dari perspektif ini, proteolisis dapat berfungsi untuk menghancurkan sebuah protein, namun ia dapat secara seimbang menyediakan sebuah mekanisme untuk memberikan sel akses bersyarat ke sebuah molekul pensinyalan khusus. Secara bermakna ditunjukkan bahwa, produk-produk pemecahan oleh MMP dapat berfungsi secara lokal (sebagai contoh, pengaktifasian khemokin). Meskipun bahwa banyak fenotip MMP telah terobservasi dalam remodelling jaringan yang tidak memerlukan MMPs bagi pembentukan awal mereka, adalah terdorong untuk berspekulasi bahwa MMPs mungkin berfungsi secara spesifik sebagai pengatur motilitas sel pasca-embryonik dan arsitektur jaringan.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar